بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات

بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.مسترداک در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان”بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR ” با گرایش زراعت و اصلاح نباتات و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

 

چکیده بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR:

گیاه بارهنگ با نام علمی(Plantagomajor.L) جزء خانواده Plantaginaceae می­باشد.از موسیلاژ این گیاه در فرآورده­های دارویی و آرایشی استفاده می­گردد. به منظور بررسی تنوع حاصل از کشت بافت در کالوس­های حاصل از گیاه بارهنگ، ۱۸ تیمار حاصل از کالوس­های القا شده از ریزنمونه­ های مختلف در غلظت­های متفاوت هورمونی به همراه یک نمونه شاهد انتخاب و DNA ژنومی با استفاده از روش CTAB استخراج و تنوع موجود بین نمونه ­ها با استفاده ۶ پرایمر از نشانگر­های ISSR بررسی شد. بررسی تنوع سوماکلونال حاصل در شرایط مختلف کشت، ریزنمونه ­ها و واکشت­ها با استفاده از نشانگر­های ISSR نشان دهنده الگوی نواری متفاوت در بین کالوس­های حاصل از ریزنمونه ­های مختلف در محیط­ها و واکشت­های متفاوت بود متوسط تعداد باندهای چند شکل با در نظر گرفتن تمام ۵۹ باند پلی­مورف برابر ۸۳/۹ باند به ازای هر آغازگر بدست آمد

. تجزیه کلاستر به روش UPGMA و ضریب تشابه دایس با استفاده از نرم‌افزار DARwin انجام شد. دندروگرام حاصل از تجزیه کلاستر انجام شده، ژنوتیپ­های مورد بررسی را در ۶ گروه طبقه ­بندی نمود. همچنین مقادیر تشابه ژنتیکی برآورد شده بین افراد بر اساس ۵۹ باند پلی­مورف بین مقادیر ۲۷/۰ تا ۸۳/۰ با متوسط ۵۴/۰ بدست آمد.

 

مقدمه

قدمت شناخت خواص دارویی گیاهان، شاید بیرون از حافظه تاریخ باشد. یکی از دلایل مهم­ این قدمت، حضور باورهای ریشه­دار مردم سرزمینهای مختلف در خصوص استفاده از گیاهان دارویی است. اطلاعات مربوط به اثرها و خواص دارویی گیاهان، از زمانهای بسیار دور به تدریج سینه به سینه منتقل گشته و با آداب و سنن قومی درآمیخته و سرانجام در اختیار نسلهای معاصر قرار گرفته است. طبق برخی «سنگ‌نوشته‌ها» و شواهد دیگر، به نظر می­رسد مصریان و چینیان در زمره نخستین اقوام بشری بوده­اند که بیش از ۲۷ قرن قبل از میلاد مسیح، از گیاهان به عنوان دارو استفاده کرده و حتی برخی از گیاهان را برای مصرف بیشتر در درمان دردها کشت کرده­اند(امیدبیگی، ۱۳۸۶).

گیاهان دارویی از هزاران سال پیش به عنوان یکی از مهمترین منابع دارویی کاربرد داشته­اند. سازمان بهداشت جهانی تخمین­زده است که بیش از ۸۰% از مردم به صورت سنتی و یا مدرن از گیاهان دارویی استفاده می­کنند. بعلاوه برخی از داروهای شیمیایی نیز با الگوبرداری از مواد گیاهی ساخته شده­اند (تریپاتی، ۲۰۰۳). اگرچه تقاضا برای این ترکیبات افزایش یافته است اما برخی از این گیاهان، زیستگاه­های طبیعی محدود دارند و بسته به شرایط محیطی و جغرافیایی محل رویش گیاه، جمع­آوری آنها با مشکلاتی مواجه است. غلظت پایین این ترکیبات در گیاه محدودیت منابع طبیعی، تخریب روزافزون جنگل­ها و مراتع و فضای سبز، نابودی گونه­های متنوع گیاهی و جانوری، مشکلات مرتب با اهلی نمودن و کشت زراعی این گیاهان، توجه محققین را به استفاده از راهکارهای فناوری زیستی جهت افزایش تولید و بهره­وری گیاهان دارویی معطوف نموده است. فناوری زیستی با بهره­گیری از علوم مختلف مانند بیولوژی، بیوشیمی، ژنتیک و … با استفاده از راهکارهای کشت سلول­ها، اندام­ها و بافت­ها، مهندسی ژنتیک و نشانگرهای مولکولی قادر است کارایی گیاهان را به عنوان منابع تجدیدپذیر جهت تولید دارو افزایش دهد(کومار، ۲۰۰۸).

کشت سلول، بافت­ها و اندام­های گیاهی امکان تکثیر انبوه و سریع گیاهان و تولید متابولیت­های ثانویه را در شرایط درون شیشه­ای (Invitro) فراهم می­سازد. با استفاده از این سیستم کشت، علاوه بر دسترسی به منبع اولیه دارو در شرایط کنترل شده و مستقل از محیط، افزایش تولید ترکیبات جدید نیز امکان­پذیر می‌گردد(بورگاد، ۲۰۰۲).

تاکنون کشت سلولی طیف وسیعی از گیاهان دارویی بررسی شده است و ترکیبات مهمی نظیر: فلاونوئیدها، تانن­ها، الکالوئیدها و ترپنوئیدها از این طریق تولید شده­اند(امیدی، ۱۳۸۸).

 

 

اهداف مشخص تحقیق بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR:

در این پژوهش اهداف ذیل دنبال می­شود:

  1. بررسی و مطالعه وقوع تنوع سوماکلونال در نمونه­های حاصل از کشت بافت گیاه بارهنگ با استفاده از نشانگرهای ISSR
  2. بررسی تاثیر نوع ریز­نمونه، ترکیبات محیط کشت و تعداد واکشت بر میزان پلی­مورفیسم در نمونه­های گیاه بارهنگ

 

نتیجه­ گیری

شش آغازگر ISSR در مجموع ۶۰ باند واضح و قابل  امتیازدهی تولید کردند  که از این تعداد ۵۹ باند پلی­مورف حاصل گردید. تفاوت­های مشاهده شده در تعداد کل باندهای ISSR و نیز باندهای اختصاصی در بین گیاه شاهد و تیمارهای حاصل از سه واکشت، بیانگر تفاوت ژنتیکی نمونه­ها است که ناشی از تنوع حاصل از کشت بافت(تنوع سوماکلونال) می­باشد. حضور باند اختصاصی در گیاه شاهد و فقدان آن در تیمارهای حاصل از واکشت­های مختلف، نشان دهنده فقدان جایگاه اختصاصی در پروسه کشت بافت است و تفاوت­های مشاهده شده در الگوی ISSR ممکن است ناشی از عوامل مختلف همچون ایجاد جایگاه اتصال جدید پرایمر و یا از بین رفتن جایگاه اتصال آن در اثر وقوع موتاسیون­های نقطه­ای یا دخالت عناصر ترانسپوزونی باشد. بنابراین می­توان اظهار کرد شرایط کشت بافت باعث القاء تغییرات ژنتیکی متنوعی در نمونه­های مختلف شده است. به نظر می­رسد که تنوع ژنتیکی القاء شده در نمونه­ها با گذشت زمان تعداد واکشت­ها افزایش یافته است چرا که نمونه­های  حاصل از واکشت­ها، از ژنوتیپ گیاه شاهد فاصله دارند. گزارشات گاج(۲۰۰۴) نیز حاکی از آنست که میزان تغییرات ژنتیکی در هسته سلول معمولاً با زیاد شدن سن کشت و افزایش تعداد واکشت­ها بیشتر می­شود و میزان و نوع این تغییرات به ترکیبات محیط کشت بویژه تنظیم کننده های رشد بستگی دارد. بررسی­های مولکولی بر روی ژنوم گیاهان مختلف که تنوع سوماکلونال را نشان دادند ثابت کرد که قسمتی از ژنوم گیاه حساس و مستعد به استرس است و میزان وقوع موتاسیون در این قسمت نسبت به بقیه ژنوم بیشتر است.

تنوع سوماکلونال یک فرایند تصادفی است که نه تنها روی ژن و نهایتاً مورفولوژی گیاه اثر می‌گذارد، بلکه باعث تغییر بیان ژن و کنترل آن می­شود. با توجه به اینکه تنوع سوماکلونال بیشتر در اثر وقوع  انواع جهش­ها می­باشد، بنابراین باید از تکنیک­های ارزیابی مناسبی برای تشخیص انواع جهش­ها در کشت بافت استفاده شود. نگزاهایو و همکاران(۲۰۰۷)، در مطالعه تنوع سوماکلونال در سطح  DNAدر برنج با استفاده از دو مارکر RAPD و ISSR، گزارش نمودند که وقوع تنوع سوماکلونال وابسته به وقوع متیلاسیون عمدتاً در نوکلئوتیدهای سیتوزین می­باشد.

لی و همکاران(۲۰۰۶)، در آنالیز گیاهچه های نخل روغنی حاصل از کشت بافت با استفاده از مارکر مولکولی AFLP ، از دو گروه آنزیمهای حساس و غیر­حساس به متیلاسیون در مرحله هضم آنزیمی استفاده نمودند. با استفاده از سیستم(MSAP)  Methylation- sensetive amplification polimorphism چند­شکلی بالائی در استفاده از آنزیمهای حساس به متیلاسیون مانند Hpa П جهت برش آنزیمی نمونه­های مختلف نسبت به استفاده از آنزیمهای غیر­حساس مانندI  Msp و PstI مشاهده گردید. با توجه به نتایج این تحقیق مشخص شد، ایجاد فنوتیپ غیر­طبیعی در گیاهان باززا شده در شرایط کشت بافت با ایجاد تغییرات بزرگ در سطح ژنوم پیوستگی ندارد بلکه تغییرات به دلیل بروز متیلاسیون در قسمتهایی از ژنوم می­باشد.

 

فهرست مطالب بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR:

چکیده ۱
فصل اول: مقدمه و کلیات ۲
۱-۱- مقدمه ۳
۱-۱-۲- گیاهان دارویی ۴
۱-۱-۳- گیاهانی که به عنوان گیاه دارویی شناخته می شوند ۴
۱-۱-۴- دلایل رویکرد به گیاهان دارویی ۵
۱-۱-۵- مواد مؤثره گیاهان دارویی

۱-۱-۵-۱- متابولیت های ثانویه

۶

۷

۱-۱-۵-۲- طبقه بندی متابولیت های ثانویه ۸
۱-۱-۵-۳- تولید متابولیت های ثانویه از گیاهان دارویی ۱۰
۱-۱-۵-۴- راهکارهای افزایش متابولیت های ثانویه گیاهی از طریق کشت بافت ۱۰
۱-۱-۶- بیوتکنولوژی و کشت بافت گیاهان دارویی ۱۱
۱-۱-۷- هدف از اصلاح گیاهان دارویی ۱۲
۱-۲- بارهنگ ۱۴
۱-۲-۱- رده بندی علمی بارهنگ ۱۴
۱-۲-۲- تاریخچه بارهنگ ۱۵
۱-۲-۳- خصوصیات گیاه شناسی بارهنگ ۱۵
۱-۲-۳-۱- اختصاصات ظاهری گونه ۱۵
۱-۲-۴- چند گونه از خانواده های بارهنگ ۱۶
۱-۲-۵- محل رویش و پراکندگی طبیعی بارهنگ ۱۷
۱-۲-۶- نیازهای اکولوژیکی بارهنگ ۱۷
۱-۲-۷- ترکیبات بارهنگ ۱۸
۱-۲-۸- خواص درمانی بارهنگ ۱۹
۱-۳- کاربردهای م هم کشت بافت در اصلاح نباتات ۱۹
۱-۴- تنوع سوماکلونال ۲۰
۱-۴-۱- تنوع سوماکلونال در کشت بافت گیاهی ۲۰
۱-۴-۲- منشاء و چگونگی ایجاد تنوع سوماکلونال ۲۱
۱-۴-۲-۱- تغییرات ژنتیکی(وراثت پذیر ۲۱
۱-۴-۲-۱-۱- تغییر در سطح پلوئیدی ۲۱
۱-۴-۲-۱-۲- تغییرات ساختمانی در DNA هسته‌ای ۲۳
۱-۴-۲-۱-۳- نوترتیبی شیمری ۲۳
۱-۴-۲-۲- تغییرات اپیژنتیکی(وراثت ناپذیر ۲۴
۱-۴-۳- کنترل تنوع سوماکلونال ۲۴
۱-۴-۴- کاربرد تنوع سوماکلونال در اصلاح نباتات ۲۶
۱-۵- مارکر(نشانگر ۲۶
۱-۵-۱- انواع نشانگرهای ژنتیکی ۲۷
۱-۵-۱-۱- نشانگرهای مورفولوژیک ۲۷
۱-۵-۱-۲- نشانگرهای مولکولی ۲۷
۱-۵-۱-۲-۱- نشانگرهای پروتئینی ۲۸
۱-۵-۱-۲-۲- مارکرهای DNA ۲۸
۱-۵-۱-۲-۲-۱- مارکرهای DNA غیرمبتنی برPCR ۲۹
۱-۵-۱-۲-۲-۲- مارکرهای DNA مبتنی برPCR ۳۰
۱-۶- دلایل استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینه گیاهان دارویی ۳۲
۱-۷- اهداف مشخص تحقیق ۳۳
فصل دوم: بررسی منابع ۳۴
۲-۱- بررسی مرور منابع ۳۵
فصل سوم: مواد و روش‌ها ۴۵
۳-۱- آزمایش اول ۴۶
۳-۱-۱- مواد گياهي ۴۶
۳-۱-۲- محیط کشت ۴۶
۳-۱-۳- دستورالعمل تهیه یک لیتر محیط کشت MSFull ۴۹
۳-۱-۴-استریل کردن بذور ۵۰
۳-۱-۵- محیط کشت جوانه زنی ۵۰
۳-۱-۶- مرحله کالزایی ۵۰
۳-۲- آزمایش دوم ۵۱
۳-۲-۱- بررسی تنوع سوماکلونال در گیاه بارهنگ با استفاده از مارکر ISSR ۵۱
۳-۲-۲- مواد گیاهی ۵۱
۳-۲-۳- استخراج DNA ژنومی ۵۳
۳-۲-۴- تهیه بافرTE ۵۴
۳-۲-۵- تهیه بافر(۵x) TBE ۵۴
۳-۲-۵-۱- تهیه بافر(۱x) TBE ۵۴
۳-۲-۶- تعیین کیفیت و کمیت DNA ژنومی استخراج شده ۵۵
۳-۲-۷- انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز(PCR ۵۵
۳-۲-۸- چرخه حرارتی در دستگاهPCR ۵۶
۳-۲-۹- الکتروفورز محصول PCR بر روی ژل آگارز ۵۷
۳-۲-۱۰- توالی آغازگرهای مورد استفاده ۵۸
۳-۲-۱۱-تجزیه و تحلیل داده‌ها ۵۹
۳-۲-۱۱-۱-امتیازدهی باندها ۵۹
۳-۲-۱۱-۲- تجزیه خوشه‌ای ۵۹
۳-۲-۱۱-۳- شاخص‌های مولکولی ۶۱
فصل چهارم نتایج و بحث ۶۲
۴-۱- نتایج مربوط به بررسی الگوی باندی DNA ۶۳
۴-۲- بررسی محتوای اطلاعات چند شکل (PIC ۶۴
۴-۳- درجه تشابه ژنتیکی ۶۹
۴-۴- توزیع فراوانی فاصله ژنتیکی ۷۱
۴-۵- تجزیه خوشه‌ای ۷۱
۴-۶- نتایج حاصله از تجزیه به مختصات اصلی(PCO ۷۵
۴-۷- نتیجه‌گیری ۷۷
۴-۸- پیشنهادات ۷۹
منابع ۸۰
چکیده انگلیسی II

 

فهرست اشکال

شکل ۴-۱: کالوس ریزنمونه برگ (سمت راست) و ریزنمونه ریشه (سمت چپ)…………….. ۶۳
شکل۴-۲:الگوی باندی ۱۹ تیمار بارهنگ با استفاده از آغازگرهای IS16 (شکل بالا)وIS11 (شکل پایین  

۶۷

نمودار ۴-۳: توزیع فراوانی مقادیر فاصله ژنتیکی بین تیمارهای مورد مطالعه ۷۱
شکل ۴-۴: دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای با استفاده از ضریب تشابه دایس ۷۴
شکل ۴-۵: ترسیم بای پلات ۱۹ تیمار مورد بررسی بر اساس دو محور مختصات اصلی اول و دوم  

۷۶

 

 

فهرست جداول

جدول ۳-۱: ترکیبات معدنی محیط پایه MS کامل ۴۶
جدول ۳-۲: دستور العمل تهیه یک لیتر محیط پایه MS ۴۷
جدول ۳-۳:اجزاء سازنده استوک عناصر ماکرو ۴۷
جدول ۳-۴:اجزاء سازنده استوک عناصر میکرو ۴۸
جدول ۳-۵:اجزاء سازنده استوک عناصر میکروII ۴۸
جدول ۳-۶: اجزای سازنده استوک آهن ۴۸
جدول ۳-۷: اجزاء سازنده استوک ویتامین ۴۹
جدول ۳-۸: ترکیبات هورمونی مورد استفاده در کالزایی ۵۱
جدول ۳-۹: ریزنمونه های مورد استفاده در فاز کالزایی ۵۱
جدول ۳-۱۰: مواد گیاهی مورد استفاده ۵۲
جدول ۳-۱۱: اجزاء بافر TE ۵۴
جدول ۳-۱۲: اجزاء بافر (۵x) TBE ۵۴
جدول۳-۱۳: اجزای مورد استفاده برای تهیه ۲۰ میکرولیتر Mastermix ۵۵
جدول ۳-۱۴: چرخه حرارتی PCR ۵۶
جدول ۳-۱۵: توالی آغازگرهای مورد استفاده ۵۸
جدول ۳-۱۶ : وضعیت دو فرد j , i با همدیگر از نظر یک صفت نشانگری ۵۹
جدول ۴-۱۷ : نتایج بررسی ۱۹ تیمار گیاه دارویی بارهنگ با استفاده از نشانگر ISSR…….. ۶۶
جدول ۴-۱۸: مواد گیاهی مورد استفاده ۶۸
جدول ۴-۱۹: ماتریس تشابه بر اساس نشانگر ISSR و ضریب تشابه دایس ۷۰
جدول ۴-۲۰: گروه بندی تیمارها بر اساس تجزیه خوشهای ۷۳
مراحل خرید فایل دانلودی
اگر محصول را می پسندید لطفا آنرا به اشتراک بگذارید.

دیدگاهی بنویسید

0