دانلود پایان نامه بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های Fusarium oxysporum f. sp. ciceri عامل بیماری پژمردگی نخود در استان ایلام

دانلود پایان نامه ارشد کشاورزی

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.مسترداک در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان”  بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های Fusarium oxysporum f. sp. ciceri عامل بیماری پژمردگی نخود در استان ایلام ” با گرایش بیماری شناسی گیاهی و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده بررسی تنوع ژنتیکی جدایه های Fusarium oxysporum f. sp. ciceri عامل بیماری پژمردگی نخود در استان ایلام:

نخود مهم­ترين گياه از خانواده حبوبات در حوزه مديترانه، شبه قاره هند، غرب آسيا و شمال آفريقا است. بيماري پژمردگی نخود با عامل Fusarium oxysporum f. sp. ciceri یکی از مهم­ترين بيماري­های اين گياه در جهان به­شمار مي­رود. این بیماری در تمام مناطق نخودکاری ایران گزارش شده است. بیماری همه ساله در تمام مناطق نخودکاری استان ايلام باعث خسارت فراوانی می­شود بطوری­که در برخی از مزارع به ۵۰ % تا ۷۰ % هم میرسد.

این تحقیق به منظور بررسی و تعیین تنوع ژنتیکی قارچ عامل بیماری زردی و پژمردگی نخود انجام گرفت. برای این منظور از مناطق نخودکاری استان شامل شش شهرستان از جمله آسمان­آباد، ایوان، بدره، چرداول، دره­شهر، سرابله نمونه­برداری صورت گرفت. پس از جداسازی، خالص­سازی و شناسایی قارچ عامل بیماری و معرفی F. oxysporum f. sp. ciceri به عنوان عامل غالب بیماری، بررسی تنوع ژنتیکی جدایه­ها با استفاده از پنج جفت نشانگر ریزماهواره صورت گرفت، نهایتاً در مجموع ۱۷ آلل در بین جمعیت­ها مشاهده شد نتایج تجزیه واریانس مولکولی حاکی از تنوع بالای درون جمعیتی معادل ۹۲ درصد و تنوع پایین بین جمعیت­های مناطق مختلف در حدود ۸ درصد داشت. جریان ژنی (Nm) بالا و برابر ۵۸۹/۷ به­ دست آمد.

بنابراین تمایز ژنتیکی (Gst) به میزان کمی ۰۶۱۸/۰ مشاهده گردید. دندروگرام رسم شده بر اساس فاصله ژنتیکی بین جمعیت­های مورد مطالعه در این تحقیق، نشان داد که جمعیت­های آسمان­آباد و سرابله در دو گروه جدا قرار گرفته­اند و نسبت به جمعیت-های دیگر تفاوت ژنتیکی بیشتری دارند. نتایج حاصل از این تحقیق در جهت کمک به متخصصین اصلاح نباتات و بیماری­شناسان گیاهی در جهت اصلاح ارقام نخود می­باشد.

مقدمه

نخود زراعی (Cicer arietinum L.) گیاهی خودگشن، دیپلوئید (۲n=2x=16)، یکساله با ژنوم کوچک۷۳۸mbp) ~) می­باشد [۲۷]. نخود مهم­ترين گياه از خانواده حبوبات در حوزه مديترانه، شبه قاره هند ، غرب آسيا و شمال آفريقا است [۵۷]. اصلي­ترین كشورهاي توليد­كننده نخود در جهان به ترتيب هند، پاكستان، تركيه، ايران و استراليا هستند [۴۸].

نخود، منبع بسيار مناسبي براي روي، آهن و پروتئين است. همچنين به لحاظ ميزان فيبرهاي رژيمي، بسيار غني بوده و ميزان چربي اندكي دارد که از نوع اسید­های چرب غیر­اشباع می­باشد، انواع نخود به طور متوسط داراي ۱۹ درصد پروتئين، ۱۳ درصد چربي و ۶۸ درصد كربوهيدرات مي­باشند، همچنين به لحاظ تأمين ميزان كلسيم مورد نياز نيز حائز اهميت است [۹۶]. سطح زير كشت نخود در ايران ۶۴۰ هزار هكتار و توليد ساليانة آن در حدود ۴۰۰ هزار تن است [۸۵، ۵۹، ۲۹]. طبق آمارهاي انتشار يافته از سوي سازمان خوار و بار جهاني میزان تولید جهانی این محصول در سال ۲۰۱۰ میلادی ۱۰ میلیون تن بوده که سهم ایران از آن حدود ۲۳۳۶۸۶ تن بوده است [۴۵].

قارچ Fusarium oxysporum یک پاتوژن خاکزاد با دامنه ميزباني وسيع بوده كه باعث پژمردگي آوندي در گياهان مختلف مي­شود [۲۶]. بيماري پژمردگي فوزاريومی نخود با عاملF. oxysporum f. sp. ciceri مهم­ترين بيماري خاكزاد اين گياه در جهان خصوصًا در شبه قاره هند، حوزه مديترانه و كاليفرنيا بشمار مي­رود، كاهش عملكرد ساليانه نخود در اثر این بيماري از ١٠ تا ١٥ درصد متغير است ولي بيماري مي­تواند در شرايط خاص كل محصول را از بين ببرد [۶۸]. اين بيماري در ايران نيز از اغلب مناطق نخود­كاري گزارش شده و ميزان خسارت آن در برخی نقاط کشور تا ٢٢ درصد هم برآورد شده است [۱۸]. بيماري زردي و پژمردگي نخود يكي از مهم­ترين بيماري­هاي نخود در استان ايلام می­باشد که در این استان همه ساله در تمام مناطق نخودکاری باعث خسارت فراوانی می­شود، بطوری­که در برخی از مزارع به ۵۰ %تا ۷۰ % هم می­رسد [۲۱]. از آنجایی­که نخود ارزش غذايی بسيار بالايي دارد و يكي از ارزان­ترين منابع تامين پروتئين گیاهی (بين ۱۲ تا ۳۱ درصد پروتئين) می­باشد و بیماری پژمردگی یکی از تهدید­های جدی برای این محصول محسوب می­شود، از طرفی مبارزه با اين بيماري همانند ساير بيماري­هاي خاكزاد مشكل است و کنترل این بیماری با استفاده از مواد شيميايي مقرون به صرفه نخواهد بود، بنابراین طبق بررسی بیماری­شناسان گیاهی بهترین روش کنترلی این بیماری استفاده از بذر سالم و ارقام مقاوم می­باشد.

یکی از راه­های رسیدن به ارقام مقاوم پایدار، شناخت قارچ عامل بیماری و بررسی تنوع ژنتیکی آن در مناطق کشت محصول مورد نظر است تا معرفی ارقام مقاوم با اطمینان بالایی صورت گیرد، تغییرات ژنتیکی در قارچ­های بیمارگر از جنبه تهیه ارقام مقاوم حائز اهمیت است، ردیابی این تغییرات با روش­های سنتی مستلزم صرف هزینه زیاد و از دست رفتن زمان خواهد بود. استفاده از روش­های مولکولی در تعیین تنوع ژنتیکی بین جمیت بیمارگر موجب کسب اطلاعات مربوط به وقوع نوترکیبی ژنتیکی آن­ها می­شود .

یکی از روش­های مولکولی که برای تعیین تنوع ژنتیکی جمعیت­های بیمارگر به کار می­رود نشانگرهای ریزماهواره هستند، نشانگر­های ریزماهواره ابزار قوی به منظور طبقه­بندی و مطالعه ژنتیک جمعیت­ها را فراهم می­کنند [۴۲، ۳۵]. این نشانگر­ها جایگاه­های ترکیب­شده از توالی­های ساده تکراری هستند که به صورت تصادفی در سراسر ژنوم قارچ­ها و دیگر یوکاریوت­ها پخش شده است [۹۷، ۸۶، ۶۴]. این توالی­ها عموما از چند­شکلی بالایی برخوردارند [۴۷].

این بیماری در استان ایلام خسارت زیادی وارد می­کند، و یکی از بیماری­های بسیار مهم نخود در این استان به حساب می­آید. یکی از روش­های کنترلی این بیماری، مبارزه شیمیایی می­باشد اما از آنجایی­که مبارزه شیمیایی روشی بسیار خطرناک برای محیط زیست و انسان تلقی می­شود، بهترین روش کنترل این بیماری استفاده از بذر سالم و ارقام مقاوم می­باشد. به همین دلیل بررسی تنوع ژنتیکی جدایه­های عامل بیماری با استفاده از نشانگرهای ژنتیکی این بیماری در این استان انجام می­گیرد. هدف این پژوهش آن است که با تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی، برنامه­ای یکپارچه برای مقاومت در برابر این بیماری اعمال شود.

هدف از تحقیق حاضر عبات از :

جداسازی و شناسایی قارچ عامل بیماری زردی و پژمردگی نخود و بررسی تنوع ژنتیکی قارچ عامل بیماری

فهرست مطالب
چکیده د
فهرست مطالب ه
فهرست جدول¬ها  ی
فهرست شکل¬ها ل
فصل اول

۱-۱-مقدمه ۲
فصل دوم
۲-۱- آشنایی با سیمای استان ایلام ۵
۲-۱-۱- آب و هوای استان ایلام ۵
۲-۲- جایگاه تاریخی نخود ۶
۲-۳- اهمیت و جایگاه نخود در جهان و ایران ۶
۲-۴- گیاه¬شناسی نخود ۷
۲-۴-۱- انواع نخود ۷
۲-۴-۲- ارزش غذایی دانه نخود ۸
۲-۵- موقعیت زراعی نخود در استان ایلام ۸
۲-۶- بیماری¬های نخود ۸
۲-۶-۱- بیماری پژمردگی فوزاریومی نخود ۹
۲-۶-۲- جنس فوزاریوم  ۱۰
۲-۶-۲-۱- طبقه¬بندی فوزاریوم ۱۰
۲-۶-۲-۲- نامگذاری و طبقه-بندی ۱۱
۲-۶-۲-۳- مرحله زادآوری جنسی ۱۱
۲-۶-۲-۴- مرحله غیرجنسی ۱۱
۲-۶-۳- همه¬گیری بیماری ۱۲
۲-۶-۳-۱- علائم بیماری ۱۲
۲-۶-۳-۲- چرخه بیماری ۱۳
۲-۶-۳-۳- شرایط محیطی ۱۴
۲-۶-۳-۴- گسترش بیماری ۱۴
۲-۷- روش¬های کنترل بیماری پوسیدگی ریشه نخود ۱۵
۲-۷-۱- روش زراعی ۱۵
۲-۷-۲- روش شیمیایی ۱۵
۲-۷-۳- مبارزه بیولوژیکی ۱۵
۲-۷-۴- ارقام مقاوم ۱۵
۲-۸- تنوع بیماری¬زایی و تنوع ژنتیکی .Fusarium ssp 16
۲-۸-۱- بررسی تنوع ژنتیکی F. oxysporum با استفاده از نشانگرهای  SSR 17
فصل سوم

۳-۱- نمونه-برداری ۲۴
۳-۲- جداسازی قارچ عامل بیماری از بافت¬های گیاهی آلوده ۳۲
۳-۳- محیط کشت¬های مورد استفاده ۳۲
۳-۳-۱- محیط کشت¬های جداسازی ۳۲
۳-۳-۱-۱- محیط کشت سیب¬زمینی- دکستروز- آگار ۳۲
۳-۳-۱-۲- محیط کشت پپتون- پنتاکلرونیتروبنزن- آگار ۳۳
۳-۳-۲- محیط کشت¬های خالص-سازی ۳۴
۳-۳-۲-۱- محیط کشت آب- آگار ۳۴
۳-۳-۳- محیط کشت¬های شناسایی ۳۴
۳-۳-۳-۱- محیط کشت برگ میخک- آگار ۳۴
۳-۳-۳-۲- محیط کشت مواد غذایی خاص ۳۵
۳-۴- شناسایی قارچ عامل بیماری ۳۵
۳-۵- تهیه کشت خالص و نگهداری جدایه-ها ۳۶
۳-۵-۱- روش تک اسپور کردن  ۳۶
۳-۵-۲- روش نوک-هیف ۳۶
۳-۵-۳- نگهداری کشت خالص قارچ ۳۷
۳-۶- محلول¬های رنگی مورد استفاده برای رنگ¬آمیزی و مشاهده¬ی قارچ ۳۷
۳-۶-۱- محلول اریتروزین ۳۷
۳-۶-۲- محلول آبی پنبه در آب ۳۷
۳-۷- بررسی آزمون بیماری¬زایی در گلخانه ۳۸
۳-۸- آزمایش¬های مولکولی ۳۸
۳-۸-۱- استخراج DNA  ۳۸
۳-۸-۱-۱- مراحل استخراج DNA  ۳۹
۳-۸-۲- بررسی کیفیت استخراج ۴۰
۳-۹- بررسی تنوع ژنتیکی جدایه¬ با کمک نشانگرهای SSR 41
۳-۱۰- تجزیه و تحلیل داده¬ها  ۴۳
فصل چهارم

۴-۱- نتایج جداسازی جدایه-ها ۴۵
۴-۱-۱- مشخصات قارچ در محیط کشت PDA 45
۴-۲- آزمون بیماری-زایی ۴۶
۴-۳- نتایج تجزیه و تحلیل داده¬های مولکولی ۴۷
۴-۳-۱- توزیع فراوانی آلل¬ها در جمعیت¬ها و جایگاه-های ریزماهواره ۴۷
-۳-۲- ویژگی آغازگرهای استفاده شده برای جدایه-ها ۴۸
۴-۳-۳- آزمون مانتل ۵۱
۴-۳-۴- گروه¬بندی جدایه¬های F. oxysporum 52
۴-۳-۵- تجزیه به مختصات اصلی در جدایه¬های F. oxysporum مورد مطالعه ۵۵
۴-۴- تنوع ژنتیکی جمعیت-ها ۵۷
۴-۴-۱- اطلاعات تنوع ژنتیکی پنج جایگاه SSR برای جمعیت¬ها ۵۷
۴-۴-۲- درصد چندشکلی در جمعیت¬های مورد مطالعه ۵۸
۴-۴-۳- بررسی فاصله ژنتیکی و شباهت ژنتیکی در جمعیت¬ها ۵۸
۴-۴-۵- بررسی میزان جریان ژنی در جمعیت-ها ۶۰
۴-۴-۶- تجزیه به مختصات اصلی و رسم بای¬پلات بر اساس نشانگر SSR 60
۴-۴-۷- تجزیه واریانس مولکولی ۶۱
۴-۵- بحث ۶۲
۴-۵-۱- نتیجه¬گیری کلی ۶۵
۴-۷- پیشنهادات ۶۶
فهرست منابع ۶۷

فهرست جدول¬ها

عنوان و شماره صفحه
جدول ۳-۱- مشخصات جدایه¬های بدست آمده از مناطق مختلف ۲۵
جدول ۳-۲- اجزای محیط کشت پپتون-پنتاکلرونیتروبنزن- آگار ۳۳
جدول ۳-۳- مواد تشکیل دهنده محیط کشت مواد غذایی خاص ۳۵
جدول ۳-۴- ترکیبات بافر استخراج DNA 39
جدول ۳-۵- مشخصات آغازگرهای ریزماهواره مورد استفاده ۴۲
جدول ۴-۱- توزیع فراوانی آلل¬ها در جمعیت-ها ۴۸
جدول ۴-۲- ویژگی¬های آغازگرهای استفاده شده ۴۸
جدول ۴-۳- شاخص نشانگری، نسبت چندگانه مؤثر و میزان چندشکلی (PIC) ۴۹
جدول ۴-۴- اطلاعات مربوط به آلل¬های موجود ۵۰
جدول ۴-۵- ضمیمه (شکل۴-۸)  ۵۵
جدول ۴-۶- تخمین تنوع ژنتیکی در جمعیت-ها ۵۷
جدول ۴-۷- درصد چندشکلی در جایگاه¬های ژنی ۵۷
جدول ۴-۸- اندازه، مشخصات و فاصله ژنتیکی بین زوج جمعیت¬ها ۵۹
جدول ۴-۹- میزان جریان ژنی (Nm) و تمایز ژنتیکی GST در جمعیت¬ها ۶۰
جدول۴-۱۰- خصوصیات مؤلفه¬های حاصل از تجزیه به مختصات اصلی ۶۱
جدول ۴-۱۱- تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) داده¬ها ۶۲
شکل ۲-۱- چرخه بیماری زردی و پژمردگی نخود ۱۳
شکل ۳-۱- موقعیت جغرافیایی مناطق نمونه¬برداری شده ۲۴
شکل ۳-۲- نمونه¬های آلوده به بیماری زردی و پژمردگی ۲۵
شکل ۳-۳- بررسی کیفیت DNA ژنومی ۴۱
شکل ۴-۱- پرگنه قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri در محیط کشت PDA ۴۵
شکل ۴-۲- تصاویر میکروسکوپی قارچ F. oxysporum f. sp. ciceri ۴۶
شکل ۴-۳- آزمون بیماری-زایی ۴۷
شکل ۴-۴- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR1 50
شکل ۴-۵- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR2 51
شکل ۴-۶- باندهای DNA حاصل از تکثیر آغازگرهای SSR9 51
شکل ۴-۷- آزمون مانتل ۵۲
شکل ۴-۸- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش UPGMA  ۵۳
شکل ۴-۹- دندروگرام ارتباط ژنتیکی به روش الحاق مجاور ۵۴
شکل۴-۱۰- نمودار دوبعدی تجزیه به مؤلفه¬ اصلی ۵۶
شکل ۴-۱۱- نمودار سه بعدی تجزیه به مؤلفه¬های اصلی ۵۶
شکل ۴-۱۲- دندروگرام ارتباط ژنتیکی ایجاد شده بوسیله UPGMA  ۵۹
شکل ۴-۱۳- نمودار دوبعدی پراکنش جمعیت-ها ۶۰
شکل ۴-۱۴- نمودار مربوط به تجزیه واریانس مولکولی جمعیت¬ها ۶۲