بهینه سازی القاء و ترانسفورماسیون ریشه موئین و همسانه‌سازی سازه‌ی فوق بیانی ژن۴′OMT در گیاه دارویی شقایق : پایان نامه ارشد مهندسی کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات

کشور عزیزمان ایران با توجه به تنوع اقلیم ، آب و هوای مطبوع و اراضی وسیعی که در اختیار دارد در صورت مدیریت در عرصه کشاورزی میتواند یکی از قطب های بلامنازع کشاورزی دنیا باشد و با پرورش دانش آموختگان خبره در گرایش های مختلف رشته کشاورزی میتوان به این مهم نایل آمد.دیجی لود در ادامه به معرفی پایان نامه های کارشناسی ارشد رشته کشاورزی میپردازد. پایان نامه حاضر با عنوان”  بهینه سازی القاء و ترانسفورماسیون ریشه موئین و همسانه‌سازی سازه‌ی فوق بیانی ژن۴′OMT در گیاه دارویی شقایق” با گرایش  کشاورزی زراعت و اصلاح نباتات و با فرمت Word (قابل ویرایش) تقدیم شما دانشجویان عزیز میگردد.

چکیده بهینه سازی القاء و ترانسفورماسیون ریشه موئین و همسانه‌سازی سازه‌ی فوق بیانی ژن۴′OMT در گیاه دارویی شقایق:

گیاه شقایق یکی از مهم‌ترین گیاه دارویی شناخته شده در دنیا و تنها منبع تجاری تولید کننده آلکالوئیدهای دارویی مانند کدوئین و مورفین است. زماني‌كه باكتري با سلول گیاهی ارتباط برقرار می‌کند،تعدادي از ژن‌هااز ناقل باكتريایی ، به ژنوم هسته‌ي گياه ميزبان وارد می‌شود.حاصل اين انتقال توليدريشه موئين درنزديكي جايگاه ورودباكترياست. ژن ۴′OMT در اواسط چرخه آلکالوئیدی گیاه شقایق قرار دارد که پیش مادهS-′۳-هیدروکسی-N-متیل کوکلارین را به S-رتیکولین تبدیل می‌کند. هر چند توالی cDNA ژن ۴′OMT در این گیاه شناسایی شده است اما تاکنون توالی ژنومی ژن ۴′OMT شناسایی نشده است.

در این تحقیق ابتدا توالی ژنومی ژن ۴′OMT شناسایی و سپس در ناقل pTZ57R/T همسانه‌سازی شد. پس از توالی‌یابی، بر اساس آنالیزهای بیوانفورماتیکی مشخص شد که این ژن دارای یک توالی اینترونی به طول bp 114 از نوکلئوتید ۷۸۱ تا ۸۹۵ می‌باشد. به منظور تشدید بیان ژن ۴′OMT ابتدا توالی cDNA ژن ۴′OMT حاوی چهارچوب خواندن باز طول bp 1074 کدکننده یک پروتئین ۳۸۵ اسیدآمینه‌ی در ناقل pTZ57R/T همسانه‌سازی شد و سپس در ناحیه بیان شونده ناقل pGSA1258(بعد از پیش‌بر قوی‌البیان ۳x CAMV35S) همسانه‌سازی گردید. در جهت بهینه‌سازی القای ریشه موئین در گیاه شقایق، یک طرح فاکتوریل در قالب بلوک کامل تصادفی با چهار تکرار اجرا شد که فاکتورهای آزمایش شامل دمای دوره‌ی هم‌کشتی در دو سطح (۲۵ و ۱۷ درجه سانتی‌گراد)، سویه‌های آگروباکتری در سه سطح (ATCC15834،A4  و GMI9534) و محیط‌ کشت پایه در دو سطح (MS و ½ MS) برای دو نوع ریزنمونه‌ی اندام هوایی و هیپوکوتیل انجام گرفت.

پس از آنالیز نتایج مشخص شد که سویه‌ی ATCC15834، دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد در دروه هم‌کشتی، محیط کشت ½ MS و ریزنمونه‌ی اندام هوایی بهترین ترکیب تیماری جهت القای ریشه موئین در این گیاه هستند. تأیید تراریختی ریشه‌های موئین با تکثیر اختصاصی ژن‌های rolB، rolC و virG انجام شد و باندی در حد مورد انتظار روی ژل الکتروفورز مشاهد شد. در مجموع نتایج نشان دهنده تراریختگی ریشه‌های موئین بدست آمده بود.

مقدمه

سابقه استفاده از گیاهان دارویی برای سلامت انسان به تاریخ باستانی بشر باز می‌گردد. به‌طوری ‌که حتی در کتب قدیمی مانند انجیل و کتاب مقدس باستانی هند  (ودا(، استفاده از برخی گیاهان در درمان بیماری‌ها توصیه شده است. اولین سند مکتوب از استفاده از گیاهان دارویی را می‌توان در پاپیروس ابرس (۱۸۰۰ سال قبل از میلاد مسیح) یافت. اما قدمت استفاده از گیاهان دارویی، به‌‌ معنی روند رو به کاهش آن در دنیای مدرن امروزی نیست. امروزه در جوامع صنعتی و در بسیاری از کشورهای پیشرفته و درحال توسعه، استفاده از طب سنتی و گیاهان دارویی برای حفظ سلامتی، به‌دلیل افزایش اعتماد مردم به استفاده از این گیاهان، بسیار چشمگیر است. گیاهان دارویی مهم‌ترین منبع از داروها برای مردم در سراسر جهان هستند (Tripathi and Tripathi, 2003).
طبق برآوردی که توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) صورت گرفته است، بیش از ۸۰ درصد مردم جهان (نزدیک به ۵ میلیارد نفر)‌، برای درمان بیماری‌ها هنوز از داروهای گیاهی استفاده می‌کنند. تقریباً یک چهارم داروهای تهیه ‌شده‌ی دنیا دارای منشأ گیاهی هستند که یا مستقیماً از گیاهان عصاره‌گیری شده‌اند و یا بر اساس ترکیب گیاهی،‌ تلفیق و سنتز شده‌اند. کار بر روی طب سنتی و استفاده از گیاهان دارویی، در سراسر جهان و به ‌خصوص هند، ژاپن، پاکستان، سریلانکا و تایلند در دست انجام می‌باشد. در اروپا و در کشورهایی از قبیل آلبانی، بلغارستان، کرواسی، فرانسه، آلمان، مجارستان، هلند، اسپانیا و انگلستان و همچنین ترکیه، حدود ۱۵۰۰ گونه از گیاهان دارویی و معطر مورد استفاده قرار گرفته و در حدود ۱۴۰۰ محصول گیاهی در اروپا و ایالات متحده تولید می‌شود. در حدود ۲۵ درصد از داروهای تجویز شده در ایالات متحده، حاوی حداقل یک ترکیب فعال گیاهی هستند. در چین، فروش داروهای سنتی در طول ۵ سال اخیر دو برابر شده است. در هند نیز صادرات گیاهان دارویی نسبت به سال‌های قبل سه برابر شده است. تعداد زیادی از فرآورده‌های دارویی مشهور از گیاهان بدست می‌آیند. به‌طور کلی تقاضای جهانی برای داروهای گیاهی در حال رشد است (Arfin Khan et al., 2009).
گیاهان عالی‌ترین طراحان و تولیدکنندگان انواع ترکیبات کوچک هستند که به‌عنوان مواد غذایی، داروها و مواد خام صنعتی برای انسان سودمند می‌باشند. اغلب برخی از گیاهان دارویی برای درمان برخی از بیماری‌ها با استفاده از روش آزمون و خطا شناخته شده‌اند. تنها کمتر از ۲۰۰ سال پیش جداسازی اولین جزء شیمیایی فعال (متابولیت ثانویه)، مسئول اثر دارویی آن رخ داده است. امروز، بسیاری از ترکیبات مشتق شده از گیاهان در صنعت داروسازی استفاده می‌شود و همچنین گیاهان نیز به‌عنوان یک منبع مهم برای ترکیبات جدید به بشر خدمت می‌کنند (Häkkinen et al., 2013).
گیاه شقایق با نام علمی Papaver somniferum L. متعلق به خانواده Papaveraceae می‌باشد. شقایق گیاهی دیپلوئید است (۲n=22). آلکالوئیدهای شقایق (به ‌غیر ازThebaine ، Cryptopine و Protopine) در هیچ جنس گیاهی به غیر از papaver وجود ندارد. که این مسئله اهمیت گیاه شقایق را به‌عنوان تنها منبع آلکالوئیدهای گروه مورفین ( مورفین، تبائین، کدوئین، نارکوتین و …) روشن می‌کند (Tetenyi, 1997).
خواص دارویی این گیاه به ‌قدری بی‌نظیر است که شقایق به‌عنوان مهم‌ترین گیاه دارویی در دنیا شناخته شده است. این گیاه تعداد زیادی آلکالوئید بنزیل ایزوکوئینولین مختلف را تولید می‌کند که برخی از آن‌ها نظیر مورفین ضددرد، کدوئین و پاپاورین به‌عنوان شل کننده عضلات، نوسکاپین به‌عنوان داروی ضد تومور و سنگوی‌نارین به‌عنوان ضد میکروبی از نظر پزشکی دارای اهمیت می‌باشند (Di Fiore et al., 2004).
سطح زیر کشت این گیاه رو به افزایش است به‌طوری که بر طبق برآوردهای موجود، سطح زیر کشت غیرقانونی این گیاه در سال ۲۰۱۳ در دنیا به‌میزان ۲۹۶۷۲۰ هکتار رسید که بالاترین سطح زیرکشت از سال ۱۹۹۸ بوده است (United Nations Office on Drugs and Crime, 2014).
افزایش ارزش انرژی و نیروی کار از یک طرف و لزوم کنترل دقیق مزارع کشت این گیاه به‌جهت جلوگیری از سو استفاده و قاچاق از طرف دیگر کشورهای مختلف دنیا را به این فکر واداشت تا به‌فکر استحصال مستقیم آلکالوئید در واحد سطح باشند تا ضمن کاهش سطح زیر کشت، با صرف هزینه و نیروی انسانس کمتر، محصول بیشتری بدست آورند. همچنین محققین علم زیست فناوری در تلاش هستند که آلکالوئیدهای دارویی و پزشکی گیاه شقایق را در شرایط آزمایشگاهی تولید و بدست آورند. این مسئله از این جهت حائز اهمیت است که اگر بتوانند این ترکیبات دارویی را از روشی غیر از روش کشت سنتی بدست آورند تا حدودی از سو استفاده و قاچاق این گیاه دارویی جلوگیری می‌نمایند و یا از میزان خسارت‌های اجتماعی آن کاسته خواهد شد.
تولید متابولیت‌های ثانویه در درون شیشه از طریق کشت بافت‌های گیاهی امکان پذیر است. مواردی وجود دارد که میزان متابولیت‌های موجود در سلول‌های کشت بافت شده خیلی بیشتر از میزان آن در گیاه کامل است و یا حتی سلول‌های کشت بافت شده، متابولیت‌هایی تولید می‌کنند که در گیاه اولیه تولید نمی‌شود. با توجه به آنکه در طبیعت سرعت تولید متابولیت‌های ثانویه آهسته بوده و مدت زمان طولانی برای تولید لازم است، بنابراین میزان تولید اقتصادی نبوده و ضروری به نظر می‌رسد که برای تولید سریع و انبوه متابولیت‌های ثانویه و مواد دارویی، از فنون کشت بافت گیاهی به‌طور بهینه استفاده شود. کشت بافت گیاهی یکی از مهم‌ترین تکنیک‌ها در راستای تولید صنعتی متابولیت‌های ثانویه در گیاهان دارویی است، زیرا پتانسیل این مواد در شرایط طبیعی بسیار محدود می‌باشد. برخی مزیت‌های تولید متابولیت‌های ثانویه از طریق کشت بافت شامل کنترل بهینه شرایط کشت، افزودن پیش سازهای موردنیاز برای افزایش بازده و تولید متابولیت‌های ثانویه خاص می‌باشد (Hu and Min, 2006). اخيراً هدف صنعت آن است كه تكنيك‌هاي كشت درون شيشه اي گياهي را آن چنان توسعه دهد كه توليد متابوليت‌هاي ثانويه نسبت به استحصال آن‌ها از گياه كامل يا سنتز آزمايشگاهي ارزان تر شود. بزرگ‌ترین چالش موجود در اين زمينه اين است كه متابوليت‌هاي مزبور در مرحله خاصي توليد می‌شوند و بعضي از تركيبات چنانچه سلول تمايز نيابد، سنتز نمی‌شوند. بنابراين، در برخي موارد كشت سلولهاي گياهي تمايز نيافته، توان بيوسنتزي فراورده‌های ثانويه را از دست می‌دهند. با توجه به نتايج بدست آمده از كشت بافت‌های تمايز يافته بيشتر پژوهش‌ها بر كشت ریشه‌های موئين تاكيد دارند (Hu and Min, 2006).
ريشه مويين نوعي بيماري گياهي است كه توسط يك باكتري گرم منفي خاكزي به‌نام آگروباكتري رايزوژنز (Agrobacterium rhizogenes) ايجاد می‌شود. زماني‌كه باكتري وارد گياه می‌شود، تعدادي از ژن‌ها از پلاسميد باكتري، به گياه منتقل شده و وارد ژنوم هسته‌اي گياه ميزبان می‌شود. حاصل اين انتقال توليد ريشه موئين در نزديكي جايگاه ورود باكتري است (Sevon and Caldentey, 2002)
تکنولوژی‌های نوین کشت بافت شامل کشت ریشه‌های موئین در جهت استحصال متابولیت‌های ثانویه دارای محاسنی هستند که توجه این محققین را به‌خود جلب کرده است. شاخصه‌ی ریشه‌های موئین ناشی از A. rhizogenes، شامل رشد سریع ریشه‌ها و شاخه‌های زیاد با تراکم بیوماس بالا بر روی یک محیط عاری از فیتوهورمون است. این ریشه‌های پایدار، به‌دلیل ثبات ژنتیکی و بیوشیمیایی ذاتی، متابولیت‌های ثانویه را در طی یک دوره طولانی تولید می‌کنند (Majumdar et al., 2011).
کشت ریشه‌های موئین تراریخته یک سیستم مدل مفید جهت بررسی بیوسنتز آلکالوئیدها و دیگر متابولیت‌های ثانویه متنوع است (Rostampour et al., 2009b). تولید ریشه‌های موئین با واسطه آگروباکتری رایزوژنز یک ابزار سریع و ساده را برای معرفی و بیان ژن‌های خارجی در سلول‌های گیاهی به‌وجود می‌آورد که قادر به سنتز متابولیت‌های ثانویه‌ی ویژه هستند. این رویکرد برای تغییر تجمع آلکالوئیدهای تولید شده‌ی به‌طور طبیعی در ریشه‌ها است (Park and Facchini, 2000).
امروزه مهندسی متابولیک، روشی خاص برای تنظیم بیوسنتز آلکالوئیدها و دستکاری فرآورده‌های متابولیکی است که می‌توان سطح مسیرهای با ارزش میانه یا فرآورده‌های انتهایی را به وسیله تشدید بیان از یک آنزیم با سرعت محدود افزایش دهد و یا اینکه متابولیت‌های نامطلوب را از طریق خاموشی ژن از بین برده یا کاهش داد (Frick et al., 2007). مهندسی متابولیک از طریق تغییر در فعالیت آنزیم‌های بیوسنتزی، یا پروتئین‌های تنظیمی مسئول در بیان ژن‌های مسیر، تغییرات در مقدار یا ساختار شیمیایی متابولیت‌های خاص را ایجاد می‌کند (Larkin et al., 2007). در روش مهندسی متابولیت می‌توان با وارد نمودن ژن مربوط به آنزیم‌های کلیدی و قرار دادن آن‌ها در کنار پیشبرهای قوی، بیان ژن را افزایش داد. از طرف دیگر با استفاده از روش‌های خاموشی ژن، این امکان وجود دارد تا از طریق مهار تولید این آنزیم‌ها، راه متابولیکی را به‌سمت محصول مورد نظر نشانه‌گیری کرد (حسینی و همکاران، ۱۳۷۸).
تاکنون مطالعات معدودی روی ریشه موئین در گیاه شقایق صورت گرفته است (Le Flem-Bonhomme et al., 2004; Park and Facchini, 2000; Yoshimatsu and Shimomura, 1992) پس لازم است مطالعات گسترده‌تری جهت بهینه‌سازی شرایط القای ریشه موئین در این گیاه صورت گیرد. بر این اساس این تحقیق به‌منظور دستیابی به دستورالعمل مناسب و با راندمان بالا جهت القای ریشه‌های موئین در گیاه P. somniferum طراحی گردید. همچنین به‌دلیل اهمیت متابولیت‌های ثانویه‌ی این گیاه، تأثیر تشدید بیان ژن ۴′OMT و خاموشی همزمان دو ژن T6ODM و CODM روی میزان آلکالوئیدهای ریشه‌‌ موئین گیاه شقایق مورد بررسی قرار گرفت. قابل ذکر است که این تحقیق، اولین گزارش از مهندسی متابولیک ژن‌های مسیرهای آلکالوئیدی در ریشه‌های موئین گیاه شقایق در دنیا است.

فهرست مطالب

۱ فصل اول
۱-۱ مقدمه ۲
۲ فصل دوم
۲-۱ کلیات ۷
۲-۱-۱ اهمیت گیاهان دارویی ۷
۲-۱-۲ متابولیت‌های ثانویه گیاهی ۷
۲-۱-۳ اهمیت پزشکی و دارویی متابولیت‌های ثانویه ۹
۲-۲ زیست فناوری و تولید متابولیت‌های ثانویه گیاهی ۹
۲-۲-۱ کشت بافت و توليد متابوليت‌هاي ثانويه ۹
۲-۲-۲ کشت سلولی ۱۰
۲-۲-۳ کشت ریشه‌های موئین ۱۱
۲-۲-۴ مهندسی متابولیک ۱۲
۲-۲-۵ زیست فناوری و A. rhizogenes 14
۲-۳ آگروباکتری رایزوژنز ۱۵
۲-۳-۱ مکانیسم برهم کنش آگروباکتری و سلول گیاهی ۱۶
۲-۳-۲ طبقه بندی ناقل‌های Ri 17
۲-۳-۳ ژن‌های T-DNA ناقل Ri 18
۲-۳-۴ ژن‌های Rol 19
۲-۳-۵ باززايي گياه كامل از ریشه‌های موئین ۱۹
۲-۴ خصوصیات گیاه‌شناسی گیاه شقایق ۲۰
۲-۴-۱ مسیرهای بیوسنتز آلکالوئیدهای گیاه شقایق ۲۰
۲-۴-۲ آلکالوئیدهای گیاه شقایق ۲۲
۲-۵ سابقه پژوهش ۲۴
۳ فصل سوم
۳-۱ همسانه‌سازی ۳۰
۳-۱-۱ مواد گیاهی ۳۰
۳-۱-۲ سویه‌های باکتری ۳۰
۳-۱-۳ آغازگرها ۳۰
۳-۱-۴ میزبان‌های همسانه‌سازی ۳۱
۳-۱-۵ محیط کشت باکتری و آنتی بیوتیک‌ها ۳۴
۳-۱-۶ آنزیم‌های محدودگر ۳۴
۳-۲ روش‌ها ۳۵
۳-۲-۱ شناسایی، جداسازی و تکثیر ژن ۴′OMT 35
۳-۲-۲ همسانه‌سازی توالی ژنومی ژن ۴′OMT در ناقل pTZ57R/T 37
۳-۲-۳ ساخت cDNAی جهت تکثیر ژن ۴′OMT 40
۳-۲-۴ تکثیر cDNAی ژن ۴′OMT و همسانه‌سازی در ناقل pTZ57R/T 41
۳-۲-۵ همسانه‌سازی سازه‌ی فوق بیانی ژن ۴′OMT در ناقل pGSA1285 44
۳-۲-۶ تأیید مجدد سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM 46
۳-۳ کشت بافت و انتقال ژن ۴۸
۳-۳-۱ بهینه‌سازی شرایط القای ریشه‌های موئین ۴۸
۳-۳-۲ کشت بذر ۴۹
۳-۳-۳ محیط‌های تلقیح و هم کشتی ۵۰
۳-۳-۴ تلقیح و دوره هم کشتی ۵۰
۳-۳-۵ انتقال ریزنمونه‌ها به محیط گزینشگر ۵۰
۳-۳-۶ استخراج DNA از ریشه‌های موئین و طبیعی گیاه شقایق ۵۱
۳-۳-۷ واکنش PCR 51
۳-۴ انتقال سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به آگروباکتری رایزوژنز ۵۲
۳-۴-۱ انتقال سازه‌ی فوق بیانی ژن ۴′OMT به آگروباکتری رایزوژنز ۵۳
۳-۴-۲ انتقال سازه‌ی خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM به ریشه‌های موئین ۵۳
۳-۴-۳ انتقال سازه‌ی فوق بیان ژن ۴′OMT به ریشه‌های موئین گیاه شقایق ۵۳
۳-۴-۴ آنالیز تراریزش ریشه‌های موئین با سازه خاموشی diox 54
۳-۴-۵ PCR در زمان واقعی ۵۴
۴ فصل چهارم
۴-۱ نتایج همسانه‌سازی ۵۷
۴-۱-۱ تکثیر توالی ژنومی ژن ۴′OMT و تأیید آن با هضم آنزیمی ۵۷
۴-۱-۲ تأیید همسانه‌سازی توالی ژنومی ژن ۴′OMT در ناقل pTZ57R/T 58
۴-۱-۳ نتایج بررسی بیوانفورماتیکی توالی ژنومی ژن ۴′OMT 60
۴-۱-۴ تأیید همسانه‌سازی cDNA ژن ۴′OMT در ناقل pTZ57R/T 64
۴-۱-۵ تأیید همسانه‌سازی ژن ۴′OMT در ناقل pGSA1285 66
۴-۱-۶ تأیید مجدد سازه‌ی خاموشی diox با هضم آنزیمی ۶۸
۴-۲ نتایج کشت بافت و انتقال ژن ۶۹
۴-۲-۱ نتایج بهینه‌سازی القای ریشه موئین ۶۹
۴-۲-۲ درصد القای ریشه موئین ۷۱
۴-۲-۳ تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یک سانتی‌متر ۷۷
۴-۲-۴ تعداد ریشه موئین در ریزنمونه ۷۸
۴-۲-۵ روند تولید ریشه موئین برای سویه‌های مختلف ۷۹
۴-۲-۶ بررسی تراریختی ریشه‌های موئین با PCR 81
۴-۲-۷ تأیید انتقال سازه‌ی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز ۸۲
۴-۲-۸ نتایج تایید تراریزش سازه خاموشی در ریشه‌های موئین با PCR 84
۴-۲-۹ نتایج آنالیز PCRدر زمان واقعی ۸۵
۴-۳ پیشنهادات ۹۰
منابع ۹۱
پیوست‌ها ۱۰۰
فهرست اشکال شماره صفحه
شکل ‏۲۱: مکانیسم مولکولی خاموشی پس از رونویسی (Borgio, 2009). 14
شکل ‏۲۲: شکل شماتیک نقشه ژنی ناقل Ri نوع مانوپین A. rhizogenes (Ozyigit et al., 2013). 17
شکل ‏۲۳: شکل شماتیک نقشه ژنی ناقل Ri نوع آگروپین A. rhizogenes (Ozyigit et al., 2013). 18
شکل ‏۲۴: مسیر سنتز آلکالوئیدهای مختلف در گیاه شقایق (Beaudoin and Facchini, 2014). 22
شکل ‏۳۱: ساختار ناقل همسانه‌سازی pTZ57R/T. 32
شکل ‏۳۲: ناقل اختصاصی pGSA1285. 33
شکل ‏۳۳ : دیاگرام سازه‌ی فوق بیانی ژن ۴′OMT. 44
شکل ‏۳۴: مشابهت توالی دو ژن T6ODM و CODM و قطعه خاموشی. ناحیه مشترک دو ژن به رنگ طوسی و ناحیه قرمز رنگ مربوط به ناحیه ترجمه نشدنی انتهای ′۳ ژن‌ها است. ناحیه سیز رنگ با نام DIOX-a نشان دهنده قطعه خاموشی است. ۴۶
شکل ‏۳۵ : دیاگرام سازه خاموشی مشترک دو ژن T6ODM و CODM در ناقل pGSA1285. 47
شکل ‏۴۱: گرادیان دمایی جهت تکثیر توالی ژنومی ژن ۴′OMT در گیاه شقایق. چاهکkb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی، چاهک‌های ۱ تا ۷ به ترتیب دماهای اتصال: ۲/۴۷، ۶/۴۷، ۷/۴۹، ۵۱، ۸/۵۳، ۱/۵۶ و ۴/۵۷ درجه سانتی‌گراد. ۵۷
شکل ‏۴۲: هضم محصول PCR ژن ۴′OMT با آنزیم HindIII. Kb1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک ۱: قطعات برش خورده ژن ۴′OMT، چاهک ۲: محصول PCR برش نخورده ژن ۴′OMT. 58
شکل ‏۴۳ : تکثیر توالی ژنومی ژن ۴′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu، چاهک ۱Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- :کنترل منفی، چاهک‌های ۴-۱: نمونه‌های تکثیری. ۵۹
شکل ‏۴۴ : کلنی PCR برای تأیید حضور توالی ژنومی ژن ۴′OMT در ناقل pTZ57R/T. چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت، چاهک‌های ۱-۲۲: کلنی‌های انتخابی. ۵۹
شکل ‏۴۵ : هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی قطعه ژنومی ژن ۴′OMT با آنزیم‌های NcoI و PmlI. چاهک ۱: ناقل T/A برش نخورده حاوی قطعه ژنومی ژن ۴′OMT، چاهک‌های ۲-۵: ناقل T/A برش خورده حاوی قطعه ژنومی ژن ۴′OMT و خروج قطعه ژنومی ژن ۴′OMT. 60
شکل ‏۴۶ : نتیجه توالی‌یابی، توالی ژنومی ژن ۴′OMT، رنگ سبز نشان دهنده توالی اینترون ژن ۴′OMT و به طول bp 114 است. ۶۱
شکل ‏۴۷ : همردیفی توالی ژنومی جداسازی شده ۴’OMT با توالی موجود در Genbank در بردارنده توالی اینترون. در این شکل توالی اینترونی در ناحیه ۸۴۴ تا bp 859 قرار دارد. ۶۲
شکل ‏۴۸ : دومین‌های عملکردی موجود در ساختار پروتئین ۴’OMT 63
شکل ‏۴۹ : توالی اسیدآمینه مربوط به دومین‌های عملکردی موجود در ساختار ژن ۴’OMT. 63
شکل ‏۴۱۰ : همردیفی توالی پروتئین ۴′OMT موجود در Genbank با توالی همسانه‌سازی شده. ۶۴
شکل ‏۴۱۱ : تکثیر توالی cDNA ژن ۴′OMT با آنزیم پلیمرازی Pfu، چاهک ۱Kb : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی، چاهک C+ : کنترل مثبت (توالی ژنومی ژن ۴′OMT)، چاهک ۱-۴: محصول PCR حاصل از تکثیر ژن ۴′OMT به طول bp 1074. 64
شکل ‏۴۱۲: کلنی PCR برای تأیید حضور توالی cDNAی ژن ۴′OMT در ناقل pTZ57R/T. چاهک ۱-۲۱: کلنی‌های مورد بررسی، چاهک C- : کنترل منفی، C+: کنترل مثبت (DNA ژنومی) چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی. ۶۵
شکل ‏۴۱۳: هضم آنزیمی ناقل pTZ57R/T حاوی cDNAی ژن ۴′OMT با آنزیم‌های XhoI و SpeI. چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک ۱ : مربوط به ناقل T/A برش نخورده حاوی cDNAی ژن ۴′OMT، چاهک ۲ تا ۶: ناقل T/A برش خورده و خارج شدن ژن ۴′OMT. 65
شکل ‏۴۱۴: نتیجه توالی‌یابی همسانه‌سازی توالی cDNA ژن ۴′OMT در ناقل pTZ57R/T. 66
شکل ‏۴۱۵: کلنی PCR برای تأیید حضور ژن ۴′OMT در ناقل pGSA1285. چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل T/A حاوی ژن ۴′OMT)، چاهک‌های ۱-۷: کلنی‌های انتخابی. ۶۷
شکل ‏۴۱۶: هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 حاوی cDNAی ژن ۴′OMT با آنزیم‌های XhoI و SpeI. چاهک Kb 1 : نشانگر وزن مولکولی، چاهک ۱ : ناقل pGSA1285 برش نخورده حاوی cDNAی ژن ۴′OMT، چاهک ۲ و ۳: ناقل pGSA1285 برش خورده و خارج شدن ژن ۴′OMT. 68
شکل ‏۴۱۷: هضم آنزیمی ناقل pGSA1285 جهت تأیید سازه‌ی خاموشی diox با آنزیم‌های AscI و SpeI. چاهک ۱Kb: نشانگر وزن مولکولی، چاهک ۱: برش ناقل pGSA1285 و خارج شدن سازه خاموشی diox، چاهک ۲: ناقل برش نخورده pGSA1285 حاوی سازه‌ی خاموشی diox. 69
شکل ‏۴۱۸: توسعه ریشه موئین در گیاه شقایق بعد از تلقیح با Agrobacterium rhizogenes . A، B و C ریزنمونه اندام هوایی، به ترتیب ۸، ۱۶ و ۲۴ روز بعد از تلقیح، D : ریزنمونه هیپوکوتیل، ۱۲ روز بعد از تلقیح. ۷۱
شکل ‏۴۱۹: اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال ۱ درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند. ۷۲
شکل ‏۴۲۰: اثر دما، سویه و محیط کشت بر درصد القای ریشه موئین برای ریزنمونه‌ هیپوکوتیل در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال ۵ درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند. ۷۵
شکل ‏۴۲۱: اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد شاخه فرعی ریشه موئین در یک سانتی‌متر برای ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال ۱ درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند. ۷۸
شکل ‏۴۲۲: اثر دما، سویه و محیط کشت بر تعداد ریشه موئین در ریزنمونه اندام هوایی در گیاه شقایق. تیمار‌های دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح احتمال ۱ درصد تفاوت معنی‌داری با یکدیگر ندارند. ۷۹
شکل ‏۴۲۳: روند تولید ریشه‌های موئین (در ریزنمونه اندام هوایی) برای سویه‌های آگروباکتری رایزوژنز در روزهای ۸، ۱۲، ۱۶، ۲۰ و ۲۴ (DAI). در محیط MS و دمای ۱۷ و ۲۵ درجه سانتی‌گراد به ترتیب (الف و ب)، در محیط ½ MS و دمای ۱۷ و ۲۵ درجه سانتی‌گراد به ترتیب (ج و د). ۸۰
شکل ‏۴۲۴ : نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشه‌های موئین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rolB در گیاه شقایق. چاهک۱۰۰ bp : نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی (ریشه‌های معمولی)، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل Ri از A. rhizogenes)، چاهک‌های ۱ تا۱۰: ریشه‌های موئین تراریخته. ۸۱
شکل ‏۴۲۵: نتایج آنالیز PCR جهت تأیید تراریختی ریشه‌های موئین با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rolC در گیاه شقایق. چاهک bp100: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C- : کنترل منفی (ریشه‌های معمولی)، چاهک C+ : کنترل مثبت (ناقل Ri از A. rhizogenes)، چاهک‌های ۱ تا۱۰: ریشه‌های موئین تراریخته. ۸۲
شکل ‏۴۲۶: کلنی-PCR برای تأیید حضور سازه‌ی خاموشی diox در آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC15834. چاهک ۱۰۰ bp: نشانگر وزن مولکولی، چاهک C-: کنترل منفی، چاهک C+: کنترل مثبت (ناقل pGSA1285 حاوی سازه خاموشی diox)، چاهک‌های ۱ تا ۶: کلنی-PCR‌های آگروباکتری رایزوژنز. ۸۳
شکل ‏۴۲۷ : تأیید انتقال سازه‌ی خاموشی diox به آگروباکتری رایزوژنز سویه ATCC 15834 با PCR. bp 100 : نشانگر وزن مولکولی، ۱C- : کنترل منفی (آب)، ۲C- : کنترل منفی (باکتری E.coli بدون سازه)، ۱C+ : کنترل مثبت (ناقل pGSA1285 حاوی سازه خاموشی diox)، ۲C+ : کنترل مثبت (باکتری E.coli حاوی سازه خاموشی diox)، ۱ و ۲: نمونه‌های تکثیری با آغازگرهای pGSA-F و nptII-R1. 83
شکل ‏۴۲۸: ظهور ریشه‌‌های موئین روی ریزنمونه‌ی اندام هوایی در گیاه شقایق، سه هفته پس از تلقیح با آگروباکتری رایزوژنز سویه‌ی ATCC15834 حاوی سازه خاموشی مشترک Diox. 84
شکل ‏۴۲۹: قسمت الف، ب و ج) به ترتیب تکثیر اختصاصی ژن‌های rolB، rolC و virG در کلون‌های ریشه موئین. چاهک bp 100: نشانگر وزن مولکولی، چاهک -C : کنترل منفی، چاهک C+ : کنترل مثبت (ناقل ATCC15834)، چاهک ۱-۲۰: کلون‌های ریشه موئین. د) چاهک Kb 1: نشانگر وزن مولکولی، چاهک -C : کنترل منفی، چاهک ۱-۲۰: کلون‌های ریشه موئین جهت بررسی وجود سازه خاموشی diox. 85
شکل ‏۴۳۰ : منحنی جذب فلورسنت نمونه‌های مورد آنالیز، خط افقی قرمز رنگ، نشان دهنده حدآستانه (Threshold) می‌باشد که محل تقاطع آن با هر کدام از منحنی‌ها شاخص CT تعیین شد. ۸۶
شکل ‏۴۳۱ : نمایش منحنی ذوب نمونه‌های مورد آنالیز مربوط به ژن T6ODM (پیک‌های سمت چپ) و ELF1 (پیک‌های سمت راست)، پیک‌های که در دمای پائین‌تر هستند نشان دهنده قطعات کوچکتر هستند. ۸۷
شکل ‏۴۳۲: میزان بیان ژن T6ODM در کلون‌های ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox (2) در مقایسه با ریشه های موئین شاهد (۱). ۸۸
شکل ‏۴۳۳: میزان بیان ژن CODM در کلون‌های ریشه موئین تراریخته با سازه خاموشی مشترک Diox (2) در مقایسه با ریشه های موئین شاهد (۱). ۸۸

فهرست جداول

جدول ‏۳۱: آغازگرهای رفت و برگشتی مورد استفاده ۳۱
جدول ‏۳۲ : آنتی بیوتیک‌ها و غلظت‌های مورد استفاده ۳۴
جدول ‏۳۳: آنزیم‌های برشی محدودگر مورد استفاده ۳۴
جدول ‏۳۴: محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن ۴′OMT 36
جدول ‏۳۵: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن ۴′OMT 36
جدول ‏۳۶ : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با آنزیم HindIII 37
جدول ‏۳۷: محتویات واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن ۴′OMT با استفاده از آنزیم pfu. 38
جدول ‏۳۸: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر توالی ژنومی ژن ۴′OMT با استفاده از آنزیم pfu 38
جدول ‏۳۹ : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژنومی ژن ۴′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T 39
جدول ‏۳۱۰ : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم NcoI و PmlI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. ۴۰
جدول ‏۳۱۱: اجزای ترکیب ساخت cDNA جهت تکثیر ژن ۴′OMT. 41
جدول ‏۳۱۲ : محتویات واکنش PCR برای تکثیر cDNAی ژن ۴′OMT با استفاده از آنزیم pfu. 42
جدول ‏۳۱۳ : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر cDNAی ژن ۴′OMT با استفاده از آنزیم pfu 42
جدول ‏۳۱۴ : اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق cDNAی ژن ۴′OMT به داخل ناقل pTZ57R/T 43
جدول ‏۳۱۵ : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoI و SpeI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. ۴۳
جدول ‏۳۱۶ : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم XhoIو SpeI مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. ۴۵
جدول ‏۳۱۷: اجزای مورد استفاده در واکنش الحاق توالی ژن ۴′OMT به داخل ناقل pGSA1285. 45
جدول ‏۳۱۸ : محتویات واکنش PCR برای تأیید سازه‌ی خاموشی Diox. 47
جدول ‏۳۱۹: سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تأیید سازه‌ی خاموشی Diox. 48
جدول ‏۳۲۰ : مخلوط واکنش هضم آنزیمی با دو آنزیم AscI و SpeI. مخلوط حاصل به مدت دو ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. ۴۸
جدول ‏۳۲۱ : محتویات واکنش PCR برای تکثیر ژن‌های rolB و rolC. 52
جدول ‏۳۲۲ : سیکل دمایی و زمانی واکنش PCR برای تکثیر ژن‌های rolB و rolC. 52
جدول ‏۳۲۳: اجزای واکنش Real-time PCR برای بررسی بیان ژن‌های T6ODM و CODM. 54
جدول ‏۴۱: نتایج تجزيه واريانس براي صفات مورد بررسی در ریزنمونه اندام هوایی و هیپوکوتیل ۷۰

راهنمای خرید و دانلود فایل

برای پرداخت، از کلیه کارتهای عضو شتاب میتوانید استفاده نمائید.

بعد از پرداخت آنلاین لینک دانلود فعال و نمایش داده میشود ، همچنین یک نسخه از فایل همان لحظه به ایمیل شما ارسال میگردد.

در صورت بروز  هر مشکلی،میتوانید از طریق تماس با ما  پیغام بگذارید و یا در تلگرام با ما در تماس باشید، تا شکایت شما مورد بررسی قرار گیرد.

برای دانلود فایل روی دکمه خرید و دانلود  کلیک نمایید.